Sonderforschungsbreich 35

Transmembrane Transporters
in Health and Disease

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Projekte

Frühere SFB 35 Projekte:


Wechselwirkung von niedermolekularen Liganden mit Membran- Transportern und ihre mögliche Rolle als pharmakologische Chaperone

Peter Chiba

In der ersten Förderperiode wurde eine neues Konzept für die Interaktion von Substraten mit dem ABC Transporter P-Glycoprotein entwickelt. Es konnte gezeigt werden, dass (i) auf Grundlage der rotationalen Pseudosymmetrie des Transporters Sustrate zu einem dualen Interaktionsmodus befähigt sind und (ii) neuartige chemische Grundgerüste in der Lage sind prozessierungsdefiziente Mutanten an ihren korrekten zellulären Ort, die Plasmamembran zu bringen. Auf Basis unserer Ergebnisse sollen (i) die Interaktionsstellen von ABC Transportern mit kleinen Moleukülen als Grundlage für pharmakologische Intervention studiert werden; (ii) die Interaktion auf einem Einzelmolekülniveau charakterisiert werden; (iii) die Interaktion des hepatischen Transporters ABCB11 und prozessierungsdefizienter Mutanten mit kleinen Molekülen, sowie deren Einfluss auf intrahepatische Cholestase studiert werden. Darüberhinaus wird die produktive Zusammenarbeit mit den Teilprojekten Ecker und Müller fortgesetzt.


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Die molekulare Basis der Substanz-Transporter-Interaktion

Gerhard F. Ecker

Für membranständige Proteine sind nur sehr wenige Strukturen in molekularer Auflösung verfügbar. Es müssen daher sehr oft Homologiemodelle zur Aufklärung der molekularen Grundlagen für eine Arzneistoff-Protein Bindung verwendet werden. Im Falle der ABC-Transporter under Transporter für Serotonin und GABA stehen mit kürzlich veröffentlichten Röntgenstrukturen nunmehr interessante Templates für Proteinhomologiemodellierung zur Verfügung. Im Rahmen des Projektes werden wir eine Kombination von Liganden-basierten Ansätzen und Docking verwenden um auf molekularer Ebene die Interaktion mit den transmembranären Transportern ABCB1, SERT und GAT1 zu studieren. Unter Berücksichtigung der Polyspecifität einzelner Targets werden die docking Posen umfangreich validiert, wobei unter anderem Photoaffinity Labelling, Mutagenesestudien und die Erstellung von Struktur-Aktivitäts-Modellen zur Anwendung gelangen. Konsistente Binding-Hypothesen werden als Grundlage für in silico Screening von großen Substanzbibliotheken dienen.


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ER-Export von Neurotransmitter-Transportern

Michael Freissmuth

Die Arbeiten der ersten Förderperiode haben den Nachweis erbracht, dass (i) der Serotoinntransporter sich von anderen Mitgliedern der SCL6-Transporterfamilie dadurch unterscheidet, dass er spezifisch auf SEC24C für den Export aus dem ER angewiesen ist, (ii) der COPII-abhängige Export aus dem ER eine Voraussetzung für eine korrektes Targeting in das axonale Kompartiment ist, (iii) der C-terminus des Serotonintransporter für dessen korrekte Faltung notwendig ist. Ausgehend von diesen Beobachtungen möchten wir in der nächsten Förderperiode (i) verstehen, weshalb der Serotonin-, der Noradrenalin und der Dopamintransporter selektiv mit SEC24C oder SEC24D interagieren. In der Folge wollen wir auch prüfen, ob polymorphe Varianten von SEC24C die Rate des ER Exports des Serotonintransporters beeinflussen. (ii) eine Maus generieren, in der das endogene SEC24C mit einer Version ersetzt ist, die den ER Export desSerotonintransporters nicht unterstützt. Dies sollte verhindern, dass der Serotonintransporter ins axonale Kompartiment gelangt. Hingegen sollte der Transporter nach wie vor im somatodendritischen Kompartiment akkumulieren. (iii) die Proteine idntifizieren, die die Faltung des Serotonintransporters unterstützen, um unser Modell zu überprüfen, das einen Austausch von Chaperonen und COPII-Komponenten am C-terminus postuliert. Darüber hinaus wollen wir die fruchtbare Zusammenarbeit mit Ecker fortsetzen, um Modelle der Bindungsstelle des Serotonin- und Dopamintransporters zu generieren.


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Einzelmolekülkräfte, die in Ligandenerkennung und Transportaktivität von Transmembran-Transportern involviert sind

Peter Hinterdorfer

Unsere Studien werden das Potential von Einzelmolekül-Kraft-Spektroskopie und -Mikroskopie verwenden, um Menbranproteine an Oberflächen von lebenden Zellen zu untersuchen. Wir werden dabei die Wechselwirkung von Monoamin- und ABC-Transportern mit verschiedenen Antidepressiva untersuchen, um Struktur, Funktion und Kinetik in nativer Konformation und Umgebung besser verstehen zu können. Dabei werden wir (i) die Energielandschaft der Wechselwirkung, (ii) Stöchiometrie und Kooperativität, sowie (iii) die laterale Verteilung der Liganden-Bindung an Transmembrane-Transporter erforschen. Unsere Studien sind eng verknüpft mit folgenden in diesem Konsortium verwendeten Methoden: (i) Makroskopische Bindungs- und Transport-Assays, (ii) Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie und (iii) Molecular Modelling und Molecular Dynamics Simulation (Stockner, MUV).


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Molecular structure-function analysis and inhibition of the human ABCG2 ABC transporter

Karl Kuchler

We have pursued a detailed structure-function and modeling analysis of certain yeast PDR transporters, which will continue in the second SFB phase. Fungal PDR transporters are orthologues of mammalian ABCG transporters, some of which are implicated in hepatobiliary liver diseases, antitumor resistance and gout. The key hypothesis is that the principle drug transport mechanism is conserved among PDRs and ABCGs. Thus, we will study drug transport and substrate interference in multiple-transfected MDCK cells expressing BCRP and ABCB11/BSEP, and in primary hepatocytes. The analysis will include disease-relevant BCRP mutations and structure predictions with molecular dynamics simulations and computational docking. Further, we will study the intracellular targeting mechanisms of BCRP, and the role of BCRP in hepatobiliary detoxification. Finally, we shall delineate the substrate interference of BCRP and BSEP with ABCB1/P-gp, as well as a potential function of BCRP in the chemoprotection in the blood-brain barrier.


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Molekularer Mechanismus eukaryotischer ABC Resistenz Transporter

Karl Kuchler

Hefe ABC Transporter der PDR (“pleiotropic drug resistance”) sind funktionelle Orthologe der sogenannten ABCG Familie aus höheren Zellen. Im Rahmen der zweiten SFB Phase, werden bestimmte PDR Transporter einer detaillierten Struktur-Funktionanalyse unterzogen, wobei die in silico Modellierung möglicher Strukturen als Ausgangspunkt verwendet wird. Die Erkenntnisse über die Struktur-Funktionsbeziehungen werden dann auf den ABCG2 Transporter angewendet, der in Detoxifizerung in der Leber, der Blut-Hirn Schranke sowie auch in der Gicht eine wichtige Rolle spielt. Um die molekularen Interaktionen mit anderen ABC Transportern im Detail zu analysieren, wird dieses SFB Teilprojekt eine neues zelluläres in vitro Modellsystem etablieren, mit dem die durch ABC Transporter (ABCG2, ABCB1, ABCB11) vermittelten hepatobiliären Transportprozesse und somit die Mechanismen der Leberdetoxifizierung auf molekularer Ebene studiert werden können.


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PET tracer" für die in-vivo Bildgebung von Effluxpumpen im Zentralnervensystem

Markus Müller, Oliver Langer

Therapieresistenz in Epilepsie Patienten wird unter anderem durch aktiven Efflux von Antiepileptika durch P-glykoprotein (Pgp) an der Blut-Hirnschranke verursacht, wodurch verhindert wird, dass therapeutisch wirksame Arzneistoffspiegel im Gehirn erreicht werden können. Ein diagnostisches Verfahren, das es erlaubt die Funktion/Expression von Pgp an der Blut-Hirnschranke nicht-invasiv zu bestimmen, könnte dazu verwendet werden um jene Epilepsie Patienten zu identifizieren deren Therapieresistenz durch erhöhte Pgp Expression verursacht wird, um diese Patienten in der Folge mit Pgp Inhibitoren zu behandeln (personalisierte Medizin). In der ersten Förderungsperiode haben wir ein neues Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Protokoll entwickelt, das auf gepaarten Scans mit dem radioaktiv markierten Pgp Inhibitor [11C]Tariquidar und dem Pgp Substrat (R)-[11C]Verapamil basiert und es erlaubt zerebrale Pgp Expression und Funktion unabhängig voneinander in Ratten zu messen. In der kommenden Förderungsperiode planen wir dieses neue PET Protokoll in gesunden Probanden und therapieresistenten und sensitiven Epilepsie Patienten anzuwenden, um regionale Unterschiede in zerebraler Pgp Expression/Funktion zu untersuchen. Zusätzlich werden wir in Zusammenarbeit mit Chiba und Ecker verbesserte PET Tracer zur Messung der zerebralen Pgp Expression entwickeln, die ein höheres Pgp spezifisches Signal als [11C]Tariquidar ergeben. Außerdem werden wir mit Trauner zusammenarbeiten, um die Funktion von breast cancer resistance protein (BCRP) in der Leber mit PET zu messen und mit Pollak um die Dichte des Serotonintransporters (SERT) im Gehirn von Mausmodellen zu visualisieren.


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The Large Neutral Amino Acids Transporter LAT1 in Autism

Gaia Novarino

Recently I have identified several patients affected by autism spectrum disorder (ASD) carrying mutations in the gene BCKDK. Patients carrying mutations in BCKDK hyper-metabolize serum branched chain amino acids (BCAAs). In our first manuscript, we showed that Bckdk-/- mice have neurobehavioral phenotypes resembling our patients. In addition, metabolic studies showed decreased levels of BCAAs and increased levels of other large neutral amino acids (LNAAs) in the brain of Bckdk-/- mice due to abnormal flux through the facilitative transporter, LAT1, present at the blood brain barrier (BBB). These findings suggested that the phenotype in the patients with BCKDK mutations may result from defective transport of BCAAs and LNAAs (several of which are important precursors for neurotransmitters) across the BBB. Using the Slc7a5 conditional knockout mouse, currently available in my laboratory, we would like to
i) measure steady state brain LNAA levels and LAT-1 mediated LNAA flux at the blood brain barrier (with Langer)
ii) investigate how the LAT1 transporter influences neurogenesis
iii) study how LAT1-mediated LNAAs flux influences mouse behavior (with Pollak).


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Neurotransmitter Transporter in Mausmodellen für psychiatrische Erkrankungen

Daniela Pollak

Der Wirkmechansimus der am häufigsten verwendeten Medikamente zur Behandlung von Depression beruht auf einer Inhibierung des Serotonin Transporters (SERT). Variable Sequenzen in der Promoter Region von SERT sind als genetischer Risikofaktor für die Entwicklung einer depressiven Erkrankung bekannt. Umweltfaktoren, wie chronischer Stress sind ebenfalls in die Pathogenese von Depression involviert und interagieren hierbei mit genetischen Faktoren. Die biologische Basis der äumweltbedingten Vulnerabilität zur Entwicklung von depressiven Erkrankungen ist jedoch nicht bekannt. In diesem Projekt soll untersucht werden, ob das chronischer Stress, in einem Verhaltensmodell zur Depression in Mäusen, die funktionelle Aktivität von SERT auf zellulärer und molekularer Ebene beeinflusst und welche die zugrunde liegenden Signaltransduktionswege sind.


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Stöchiometrie von Untereinheiten und supermolekulare Organisation von transmembranären Transportern

Gerhard Schütz

Wir verwenden einzelmolekulare Fluoreszenzmikroskopie, um den Oligomerisierungsgrad, die Interaktionskinetiken, die Mobilität sowie die nanoskopische Organisation von Transmembran-Transportern zu studieren. Die Verwendung von Einzelmolekülmikroskopie erlaubt es uns, über konventionelle Ensemble-Messungen hinauszugehen: Über Helligkeits- sowie Kolokalisations-Analysen werden wir molekulare Assoziationen präzise quantifizieren; die hohe Zeitauflösung von einer Millisekunde werden wir ausnutzen, um transiente Interaktionsphänomene direkt zu beobachten; schließlich werden wir durch die hohe Lokalisierungsgenauigkeit von ca. 20nm kleinste zelluläre Strukturen untersuchen können, die die Diffusionsbewegung der Transmembran Transporter Moleküle beeinflussen. In diesem Projekt werden wir uns vor allem der Untersuchung der beiden Monoamin-Transporter SERT und DAT widmen; die Studie wird in enger Zusammenarbeit mit Sitte und Freissmuth durchgeführt, welche GFP-Fusionskonstrukte, fluoreszierende Liganden, Zelllinien, sowie ex vivo kultivierte Neuronen zur Verfügung stellen. Wir werden diese Experimente mit Hinterdorfer akkordieren, der komplementäre Kraftspektroskopie verwendet, um Interaktionsenergien zwischen Transmembran-Transportern und deren Liganden bzw.Substraten zu bestimmen. Darüber hinaus sollen die entwickelten Techniken auch für die Untersuchung von ABC und PDR Transportern angewendet werden


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Struktur/Funktionsbeziehungen bakterieller und humaner Transporter Orthologe

Harald H. Sitte

Wir planen die Erforschung struktureller Grundlagen der Funktion der humanen Transporter für Serotonin und GABA (SERT und GAT1) im Vergleich zu bakteriellen Ortologen. Die Kristallstrukturdaten des bakteriellen Leuzintransporters LeuTAa eröffnete neue Welten der Transporterforschung: diese Struktur dient als Startpunkt für Vergleichsstudien, bei denen die einzelnen Aminosäurenreste der Transporterstruktur welchen Liganden binden und wie Konformationsänderungen den Transportzyklus unterhalten. Wir nehmen an, dass wir aus Modelldaten, Pharmakoinformatik sowie "Proteomik" Schlüsse ziehen können, die wir dann durch Generierung spezifischer Mutanten in biochemischen und elektrophysiologischen Experimenten verifizieren können. Wir planen ausserdem die Strukturen von SERT und GAT1 anhand der Kristallstruktur von LeuTAa zu modellieren und die Strukturen von interessanten Substanzen in diesen strukturellen Kontext "hineinzudocken". Schließlich wollen wir die gereinigten und in Lipidmembranen rekonstituierten LeuTAa-Transporter mit SERT und GAT1 in Xenopus laevis-Oozyten vergleichen.


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Investigating the pathophysiological role of ABCB6 and the mechanism of action of ABCB1

Gergely Szakacs

Wir haben vor kurzem herausgefunden, dass der vermutete mitochondriale Transporter ABCB6 ein Glykoprotein ist, das in der Membran reifer Erythrozyten vorkommt; weiter wird ABCB6 in Exosomen gefunden, die von Retikulozyten während der letzten Phase der Erythrozyten-Reifung freigesetzt wird. Vorläufige Daten bestätigen unsere Annahme, dass ABCB6 im endolysosomalen Kompartiment von HeLa-Zellen und in Melanosomen der MNT-1-Zellen gebildet wird. Unser Ziel ist das Erstellen einer Stuktur-Funktionsbeziehung dieses Transporters durch Analyse des Einflusses von Mutationen und polymorpher Varianten auf das intrazelluläre Trafficking und der Funktion von ABCB6. Wir möchten ABCB6-Varianten in Hefekulturen, Insektenzellen und verschiedenen humanen Zelllinien exprimieren, um deren Funktion und ihr intrazelluläres Trafficking zu analysieren. Ein weiteres Ziel dieses Projektteils ist es, eine mögliche Verbindung zwischen dem Schaltprozess transmembraner Domänen und ihrer Konformation und des ATPase-Zyklus des ABCB1-Transporters herzustellen. Dazu soll das Binden eines Konformations-sensitiven Anti-ABCB1-Antikörper namens UIC2, daneben auch noch ATPase-Messungen, die Markierung mit "Azido-ATP" und funktionelle Transportstudien untersucht werden. Außerdem wird zusätzlich noch die UIC2-Reaktivität, die Nukleotid- und Substrataffinität sowie das Verhältnis der Bildung und auch der Dissoziation von prä- und posthydrolytischen, katalytischen Mediatoren von ABCB1-Varianten erforscht und definiert, und zwar jene ABCB1-Varianten, die Mutationen bei der Substanzbindung und der ATPase-Sites aufweisen.


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Molekulare Regulation hepatobiliärer ABC Transporter bei cholestatischen Lebererkrankungen

Michael Trauner

Ziel dieses Projektes ist es, die Rolle hepatobiliärer/kanalikulärer ABC Transporter in der Leber als wichtige Komponente für eine Schädigung und chronische Entzündung der Gallenwege zu untersuchen. Wir werden unsere Hypothesen testen, dass (i) Störungen der Gallensäuren-Exkretion über die kanalikuläre Gallensäure-Exportpumpe (BSEP/ABCB4) in Relation zur kanalikulären Phorspholipid-Exportpumpe (MDR3/ABCB4) zu Gallengangsschädigungen führen und (ii) Breast Cancer Related Protein (BCRP/ABCG2) und Multidrug Resistance Protein (ABCB1) als potentielle kompensatorische kanalikuläre Effluxsysteme für Gallensäure, Toxine und Karzinogene bei Cholestase einspringen können, wodurch die Schädigung und Karzinogenese im Gallengangssystem weiter vorangetrieben werden könnte. Unsere Fragestellungen werden in vivo mittels Induktion cholestatischer Leberschädigungen und Exposition von Gallengangsnoxen (Xenobiotika, toxische Gallensäuren) in Mausmodellen mit Fehlen (Knockout) oder Überexpression spezifischer ABC Transporter (ABCB11, G2, B1) untersucht. Zudem werden wir die entsprechenden ABC Transporter in einem etablierten Mausmodell für die sklerosierende Cholangitis (ABCB4 Knockout Maus mit gestörter biliärer Phospholipidexkretion) hemmen bzw. durch die Generation von Doppel-Knockout-Mäusen deletieren. Das Ausmaß der cholestatischen Leber- und Gallengangsschädigung wird biochemisch (Leberwerte, Gallensäuren) histologisch (Sirius Rotfärbung, alpha-SMA Immunhistochemie für CD11b, F4/80, VCAM, K19), sowie auf molekularer Ebene (Col1a, TIMPs, MMPs für Leberfibrose; TNF, iNOS, F4/80 für hepatische Inflammation und ABC Transporter Phase I/II Enzyme und regulatorische Schlüsseltranskriptionsfaktoren der Gallensäuren-Homeostase) untersucht. Darüber hinaus werden wir die hepatobiliäre Export/Transportfunktion durch Analysen der Gallensekretion und Zusammensetzung in vivo untersuchen. Um mögliche Veränderungen vom Mausmodell auf humane Lebererkrankungen zu übertragen, werden wir Gewebe von PatientInnen mit verschiedenen cholestatischer Lebererkrankungen wie PBC und PSC auf molekuarer Ebene untersuchen. Die hepatobiliäre ABCG2 Transportfunktion bei cholestatischen Patienten (vor und nach Intervention and den Gallenwegen) und korrespondierenden cholestatischen Mausmodellen wird in Kollaboration mit Müller und unseren nationalen Kollaborationspartnern (Langer/AIT, Dudczak/ Nukleamedizin) mittels spezifischer PET-Tracer untersucht. Dieser in vivo Ansatz wird durch in vitro Transportstudien im Maus- und humanen Hepatozyten, Cholangiozyten und multiplen Transporter-transfektierten polarisierten MDCK Zellen in Kooperation mit Kuchler untersucht. Zusammenfassend sollte dieses Projekt neue mechanistische Einblicke in die Pathogenese und Progression von chronisch entzündlichen Gallenwegserkrankung liefern, welche ein wichtiges klinisches Problem und noch immer eine führende Indikation für die Lebertransplantation darstellen. Darüber hinaus sollten dieses Projekt zu neuen Therapieoptionen, welche auf hepatobiliäre ABC Transporter abzielen, führen, indem in Kooperation mit P02/Ecker und P09/Chiba spezifische Agonisten und Inhibitoren entwickelt werden.


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Membrane transporters in drug refractory epilepsy (nur in Englisch)

Christoph Baumgartner

The goal of this project part is to systematically investigate the role of multidrug transporters in medically refractory focal epilepsy affecting 30-40% of all epilepsy patients. Specifically, we will assess the relative contribution of a genetically determined inherited overexpression of multidrug efflux transporters versus an acquired and transient overexpression as a consequence of uncontrolled seizures. We will establish a data base of patients with medically refractory epilepsy undergoing presurgical evaluation at our center and perform genetic testing for polymorphisms on the expression of specific drug transporters. Patients will undergo PET scans for in vivo imaging of multidrug transporters (see project by Markus Müller). Furthermore, we will perform intraoperative electrophysiological studies to assess local epileptogenicity as well as intraoperative microdialysis to measure local drug concentrations in the resected brain tissue. The local expression of multidrug transporter proteins will be studied by subsequent histochemical analysis of the resected brain tissue. Finally, we will provide specimens of human epileptic brain tissue for further analysis by the other research groups within the SFB.


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Multimodales Imaging von humanen Gehirn-Monamin-Transportern

Lukas Pezawas

Einleitung: Serotonin (5-HT) und Dopamin (DA) sind kritisch in die Entwicklung und Funktion von Emotionshirnschalkreisen involviert und stehen klinisch in Beziehung zur Depression aber auch Temperament-bezogenen Risikofaktoren wie Angst und Impulsivität. Mittels eines Imaging Genetics und Gene Discovery Ansatzes werden Effekte funktioneller genetischer Varianten sowie potentielle Genkandidaten in SLC6A4 und SLC6A3, die mit Gemütserkrankungen sowie komorbiden Störungen wie Attention Deficit and Hyperactivity Disorder (ADHD) in Verbindung gebracht worden sind, in einer großen Stichprobe von gesunden Kontrollen und remittierten depressiven Patienten untersucht. Weiters, untersucht diese Studie den komplexen Zusammenhang zwischen DAT Funktionalität und D2-Rezeptorbindung sowie deren Korrelate auf Hirnsystemebene, ein Zusammenhang, der bis dato kaum untersucht worden ist.
Ziel: Die Charakterisierung auf Hirnsystemebene von Effekten genetischer Varianten der 5-HT und DA Transportergene auf Hirnentwicklung und –funktion sowie das Verhältnis zwischen DAT Funktionalität und D2-Rezeptor Dichte. Lokalisierte anatomische und funktionelle Meßgrößen wie regionales Volumen der grauen Substanz und subkortikaler Strukturen, kortikale Dicke, Parzellierung kortikaler Areale, BOLD Aktivität sowie Maße auf Hirnsystemebene wie funktionelle, effektive und strukturelle Konnektivität werden im Rahmen dieser Studie herangezogen, um subtile genetische Effekte zu untersuchen und diese in Zusammenhang mit D2-Rezeptor Bindungsdaten zu setzen. Verhaltensrelevante Effekte werden mittels einer neuropsychologischen Testbatterie erhoben, die zahlreiche Prädiktoren für Gemütserkrankungen auf Verhaltensebene enthält.


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Selektion stabiler Transportproteine zur Erleichterung ihrer strukturellen Charakterisierung

Peggy Stolt-Bergner

Strukturelle sowie funktionelle Untersuchungen von Transmembran-Transportproteinen bilden die Grundlage eines mechanistischen Verständnisses, wie Substrate von diesen Proteinen über die Zellmembran verschoben werden. Allerdings gestaltet sich die Arbeit an der Struktur von Membranproteinen als schwierig, einerseits wegen ihrer hydrophoben (=lipophilen) Natur, andererseits, weil sie außerhalb ihrer gewohnten Lipidumgebung (=der Membran) deutlich instabiler sind. Wir werden uns im vorliegenden Projekt auf die Produktion und Aufreinigung der Transportproteine fokussieren, die im Zentrum der Forschung dieses Konsortiums stehen, und hoffen, ausreichend große Quantitäten zu produzieren, um sowohl strukturelle als auch funktionelle Untersuchungen durchführen zu können.


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